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Le indagini in Citogenetica

Le indagini in Citogenetica

Il settore di Citogenetica effettua indagini cromosomiche su:

  • Liquido amniotico
  • Sangue periferico

Per indagini citogenetiche si intendono le analisi che consentono lo studio dell’assetto cromosomico delle cellule e quindi del cariotipo.

Diagnosi prenatale

La diagnosi prenatale permette di rilevare nel feto anomalie cromosomiche, numeriche e strutturali, alle quali sono spesso associate condizioni patologiche.

Quando si esegue

L’indagine citogenetica è eseguita in gravidanza e permette lo studio del cariotipo fetale, eseguita su villo coriale, liquido amniotico o sangue fetale. Tale prestazione in caso di gravidanza a rischio per anomalie genetiche ed anomalie cromosomiche è esente da ticket, come da protocollo regionale.

Indicazioni al prelievo di cellule fetali su liquido amniotico per diagnosi cromosomica:

  • Precedente figlio affetto da anomalia dei cromosomi
  • Età materna uguale o maggiore ai 35 anni
  • Anomalie fetali / patologie fetali  osservate in ecografia
  • Test biochimici indicanti un aumento del rischio cromosomico
  • Genitori con precedente figlio affetto da anomalia cromosomica o da malattia genetica diagnosticabile.
  • Genitori portatori di ri-arrangiamenti strutturali cromosomici a rischio di sbilanciamento nella prole

Il  materiale fetale sul quale viene eseguita l’indagine è rappresentato dagli amniociti del liquido amniotico.

Diagnosi post-natale

L’indagine citogenetica permette lo studio del cariotipo ed è eseguita su sangue periferico. Indicazioni al prelievo di linfociti su sangue periferico per diagnosi cromosomica:

  • Pregressa cromosopatia fetale o malformazione
  • Soggetti con sospetta sindrome cromosomica  o malattia genetica
  • Genitori e familiari di soggetti con anomalie cromosomiche
  • Genitori portatori di anomalia dei cromosomi
  • Genitori con riscontro citogenetico di mosaicismo cellulare
  • Soggetti con difetti, ritardo mentale o ritardo d’accrescimento
  • Causa di morte nei neonati
  • Coppie con figlio con sospetta sindrome cromosomica, deceduto senza diagnosi
  • Coppie con problemi riproduttivi – sterilità/ infertilità/ poliabortività

Indipendentemente dal campione il laboratorio assicura un livello di risoluzione cromosomica non inferiore alle 320 – 350 bande per set aploide di cromosomi.

Per il bandeggio dei cromosomi la tecnica di colorazione adoperata è quella con il Giesma – bandeggio GTG-.

Tecniche di bandeggio alternative (CBG, NOR, DA / DAPI) sono utilizzate dal laboratorio nelle situazioni in cui tali tecniche si rendono necessarie per una corretta interpetrazione del corredo cromosomico.

Citogenetica Molecolare

Le tecniche di citogenetica molecolare si basano sulla capacità delle sequenze nucleotidiche di riconoscere le sequenze complementari e di legarsi ad esse, formando molecole ibride. L’avvenuta ibridazione viene riconosciuta con metodi di fluorescenza.

La tecnica utilizzata dal nostro laboratorio è la FISH (Fluoroscent in Situ Hybridation). Si esegue :

  • nei nuclei interfasici per la diagnosi prenatale delle principali aneuploidie(alterazioni numeriche) dei cromosomi – 13,18,21, cromosomi sessuali X e Y;
  • su preparati metafasici per:
    • conferma della diagnosi sui nuclei interfasici
    • diagnosi di anomalie strutturali, delezioni e microdelezioni, definizione dei cromosomi maker.

 

Diagnostica molecolare avanzata: il CYP2C9

Il CYP2C9, uno dei membri della famiglia dei citocromi P-450, è responsabile del metabolismo di circa il 16% dei farmaci attualmente in commercio. E’ importante per il metabolismo di molti farmaci con un range terapeutico ristretto, come ad esempio la fenitoina (antiepilettico) o gli anticoagulanti Warfarina e Sintrom, nonche’ bloccanti angiotensina II, antinfiammatori non steroidei, alcuni antidepressivi a molti altri farmaci.

Esistono diverse varianti alleliche del CYP2C9, le più comuni sono la CYP2C9*2 (R144C) e la CYP2C9*3 (I359L), con una frequenza allelica nella popolazione caucasica rispettivamente del 8-18% e del 4-10%. Diversi studi condotti su pazienti in terapia con Warfarina hanno mostrato che soggetti che presentano gli alleli CYP2C9*2 e CYP2C9*3 metabolizzano i farmaci più lentamente (low-metabolizers) e necessitano quindi di un dosaggio inferiore del farmaco. Questi alleli sono stati fortemente associati con un’aumentata sensibilità alla warfarina e rischio di emorragie durante il trattamento anticoagulante.

Epidemiologia

Mutazioni nel gene per il CYP2C9, che danno origine ad un metabolismo farmacologico alterato, sono state trovate in oltre il 40% dei caucasici, di cui circa il 4% della popolazione è PM ed il 38% e’ EM. Circa il 60%, invece, presenta un metabolismo normale (EM).

Gene

PM

IM

EM

UM

CYP2C9

4%

38%

58%

N/A

Polimorfismi investigati:

Con il presente test vengono genotipizzati 12 alleli del gene CYP2C9, comprendendo oltre il 98% delle varianti alleliche conosciute per questo gene.

Mutazioni del gene CYP2C19 investigate

CYP2C9 Allele

Esone/introne

Mutazione

Effetto sulla Proteina

Effetto sull’attività enzimatica

*1

Nessuna (wild type)

Nessuno

Normale

*2

3

430C>T

R144C

Attivita’ diminuita

*3

7

1075A>C

I359L

Attivita’ diminuita

*4

7

1076T>C

I359T

Attivita’ diminuita

*5

7

1080C>G

D360E

Attivita’ diminuita

*6

5

818delA

frameshift

Nessuna Attivita’

*8

3

449G>A

R150H

Attivita’ aumentata

*9

5

752A>G

H251R

 

*10

5

815A>G

E272G

 

*11

7

1003C>T

R335W

Attivita’ diminuita

*14

3

374 G-A

R125H

Attivita’ diminuita

*18

7

1075A>C

I359L

Attivita’ diminuita

*2, *3, *4, *5, *6, *11, *14, *18

poor metaboliser

CYP2C9 allele nomenclature database 

http://www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2C9.htm

L’allele *1 del gene CYP2C9 determina un’attività enzimatica normale; soggetti omozigoti per quessto allele sono metabolizzatori estesi (EM). Esistono diverse varianti alleliche del CYP2C9, le più comuni sono CYP2C9*2 (R144C) e CYP2C9*3 (I359L), con una frequenza allelica nella popolazione caucasica rispettivamente del 8-18% e del 4-10%. Negli asiatici e negli afro-americani, la frequenza di questi alleli e’ invece molto ridotta (0.5 ”“ 4%). L’allele CYP2C9*4 e’ stato identificato esclusivamente nella popolazione giapponese, mentre il CYP2C9*5 e il CYP2C9*6 sono stati riscontrati in circa il 2% degli afro-americani. Uno stato di omozigosita’ per gli alleli CYP2C9*2 e CYP2C9*3 e’ relativamente rara (circa 1-2%) negli europei.

Gli alleli *2,*3, *4, *5, *6, *11, *14, *18, contribuiscono a determinare un’attivita’ enzimatica ridotta o assente (metabolizzatori lenti ”“ PM).

Esistono correlazioni genotipo-fenotipo per una una migliore gestione del paziente:

  • soggetti con genotipo CYP2C9*1/*1 (frequenza del 70% nella popolazione Caucasica) sono considerati metabolizzatori normali.
  • individui CYP2C9*1/ *2 (frequenza del 16% nella popolazione Caucasica) e *1/*3 (frequenza del 10% nella popolazione Caucasica) sono considerati metabolizzatori lenti.
  • esiste infine una classe di metabolizzatori molto scarsi raggruppante i soggetti a genotipo *2/*2 (frequenza dell’1%), *2/*3 (frequenza dell’1%), *3/*3 (frequenza dello 0.3%).

I polimorfismi che determinano gli alleli CYP2C9 *2, CYP2C9 *3, CYP2C9 *4, CYP2C9 *5 e CYP2C9 *6 si riscontrano in oltre il 98% dei PM.

Interpretazione dei risultati

La genotipizzazione dei sopra elencati alleli permette la discriminazione di 3 categorie di pazienti:

  • metabolizzatori lenti (Poor MetabolizerPMs): sono pazienti che presentano una mutazione in entrambi gli alleli del gene, cioe’ presentano due alleli non funzionali del gene CYP2C9 (es. *2 – *3 oppure *2 – *2). I PM sono persone con deficienze nel metabolismo che quindi hanno una capacità d’attivazione dei farmaci estremamente ridotta o assente, o presentano una ridotta capacità metabolica per numerosi composti. I PM tenderanno ad accumulare o ad eliminare più lentamente i substrati o i farmaci che sono maggiormente metabolizzati dal CYP2C9, avranno quindi una maggiore concentrazione a livello ematico del farmaco e generalmente un maggior effetto, a parità di dosaggio, rispetto ad individui che possiedono le forme funzionali dell’enzima. I metabolizzatori lenti sono più frequentemente esposti ad effetti indesiderati (ADR) se trattati con dosi standard di questi composti.
  • metabolizzatori intermedi (Intermediate Metabolizer – IM) sono pazienti portatori in eterozigosi di una mutazione, cioe’ presentano un allele normale del gene CYP2C9 ed uno non funzionale (es. *1 – *2) e possono richiedere, per conseguire un’azione terapeutica ottimale, un dosaggio farmacologico inferiore alla norma.
  • metabolizzatori estesi (Extensive MetabolizerEMs): sono persone dotate di un normale metabolismo farmacologico. Di solito presentano due alleli del gene funzionali (es. *1 – *1) o un’allele funzionale ed uno parzialmente attivo (es. *1 – *9). Di solito gli EM possono assumere i farmaci che sono substrati dell’enzima CYP2C9 ad un dosaggio standard.

Gene

PM

IM

EM

CYP2C9

Sono omozigoti o eterozigoti composti per uno degli alleli *2, *3, *4, *5, *6, *11, *14, *18

Sono eterozigoti per uno degli alleli *2, *3, *4, *5, *6, *11, *14, *18

Sono omozigoti per l’allele *1

NOTE: Il presente test genetico non ricerca mutazioni diverse da quelle elencate nella tabella di cui sopra e, sebbene permetta di diagnosticare oltre il 98% dei PM, non consente di evidenziare tutte le mutazioni che dimunuiscono l’attivita del gene CYP2C9 o che lo rendono inattivo. Per cui, un’assenza di una mutazione o polimorfismo non garantisce che il paziente presenti un fenotipo PM o IM.

Raccomandazioni sul dosaggio

Nel contesto del trattamento, le  mutazione del gene CYP2C9 possono influenzare la corretta determinazione della dose terapeutica iniziale di molti farmaci. Per i farmaci con un ristretto profilo terapeutico e con curva dose-risposta ripida, questo deficit può dare luogo sia ad un’overdosaggio che ad un’incapacità di mantenere l’efficacia terapeutica.

Per i pazienti a cui e’ stato evidenziato un profilo metabolico alterato (PM, IM), quindi, si raccomada un attento monitoraggio dell’effetto terapeutico dei farmaci somministrati. Si rammenta che i pazienti che presentano deficienze nel metabolismo, possiedono una capacità d’attivazione dei farmaci estremamente ridotta o assente, ed hanno una ridotta capacità metabolica per numerosi composti. Questi pazienti tenderanno ad accumulare o ad eliminare più lentamente i substrati o i farmaci e avranno quindi una maggiore concentrazione a livello ematico del farmaco e generalmente un maggior effetto, a parità di dosaggio, rispetto a soggetti che possiedono le forme funzionali dell’enzima. Essi sono inoltre più frequentemente esposti ad effetti indesiderati se trattati con dosi standard di questi composti. Tali pazienti, quindi, per conseguire un’azione terapeutica ottimale, possono richiedere un dosaggio farmacologico inferiore alla norma.

Un fattore che complica la correlazione genotipo fenotipo e’ il fatto che molti farmaci possono ridurre o aumentare l’attivita’ catalitica del CYP2C9. Di conseguenza, un paziente puo’richiedere una maggiore riduzione del dosaggio del farmaco rispetto a quella prevista, basata sul genotipo del paziente. Quindi e’ molto importante interpretare i risultati del test nel contesto della somministrazione contemporanea di altri farmaci.

Inoltre l’attivita’ del CYP2C9 dipende dallo stato funzionale epatico e renale. Tale attivita’ non sembra essere influenzata direttamente dall’eta’; tuttavia essa puo’ apparire alterata a causa di una variazione del flusso sanguigno epatico  o una ridotta eliminazione renale dei metaboliti dovuta all’eta’.

  • metabolizzatori lenti (Poor MetabolizerPMs): Ridurre il dosaggio di circa 20-60 % rispetto alla dose standard. Si raccomanda il monitoraggio dell’attivita’ terapeutica del farmaco per i pazienti PM per confermare che le concentrazioni del farmaco somministrato stiano ricomprese nell’intervallo terapeutico.
  • metabolizzatori intermedi (Intermediate Metabolizer – IM): Somministrare i farmaci ad un dosaggio inferiore ed evitare terapie farmacologiche multiple che inibiscono o attivano attraverso lo stesso  pathway.

Medication

Potential characteristic

Enzyme/ Protein

Potential therapeutic modification

Warfarin and other coumarin derivatives

Impaired metabolism

CYP2C9

Reduce dose to 20 – 60% of standard dosages based on genotype

Glipizide and other sulfonylureas

Impaired metabolism

CYP2C9

Reduce dose to 20 – 60% of standard dosages based on genotype

Phenytoin

Impaired metabolism

CYP2C9

Reduce dose to 20 – 60% of standard dosages based on genotype

Per ulteriori dettagli si rimanda alla seguente pubblicazione: Julia Kirchheiner, et al: The CYP2C9 polymorphism: from enzyme kinetics to clinical dose recommendations Personalized Med 2004 1(1) 63-84.

CYP2C9 e Terapia anticoagulante con acenocumarolo

L’acenocumarolo (Sintrom) è il derivato della Cumarina più usato in Europa come anticoagulante orale. Recentemente l’allele CYP2C9*3 è stato riscontrato con una prevalenza maggiore nei pazienti che necessitano di una dose bassa di Sintrom, una frequenza maggiore di sovra-anticoagulazione all’inizio della terapia ed una risposta instabile al trattamento. L’utlità di eseguire una genotipizzazione del CYP2C9 prima di iniziare una terapia con Sintrom è supportata da due recenti “case reports” dove la somministrazione di 4 mg/giorno ha portato ad una sovra-anticoagulazione con un INR maggiore di 9 al primo controllo. La genotipizzazione ha rilevato la presenza, per entrambi i pazienti, di una omozigosità per l’allele CYP2C9*3.

Trattamento: Dose ottimale di acenocumarolo in funzione del genotipo CYP2C9

CYP2C9 e Terapia anticoagulante con warfarina

La terapia con warfarina rappresenta il trattamento anticoagulante più impiegato nella pratica medico-chirurgica di molte malattie croniche. Tuttavia, di frequente insorgono complicazioni emorragiche, a causa della complessa relazione dose-risposta e stretta finestra terapeutica della warfarina, associate con frequenti variazioni interindividuale di risposta ad una data dose di warfarina. in determinati soggetti, l’attività anticoagulante dopo la somministrazione di dosi terapeutiche abituali di warfarin è marcatamente ridotta; per ottenere l’effetto desiderato può essere necessaria una dose fino a 20 volte superiore rispetto al consueto.

L’enzima coinvolto nel metabolismo della warfarina è il CYP2C9. Sono state identificate mutazioni puntiformi nel gene codificante per il CYP2C9 che risultano principalmente in due varianti alleliche: CYP2C9*2, in cui in posizione 144 un residuo di arginina viene sostituito da una cisteina, e CYP2C9*3 in cui in posizione 359 un residuo di leucina viene sostituito da una isoleucina. Tali varianti sono associate ad un’alterata idrossilazione della warfarina. I soggetti portatori delle varianti CYP2C9*2 e CYP2C9*3 richiedono un dosaggio di warfarina più basso per ottenere lo stesso effetto anticoagulante dei soggetti a genotipo normale e sono più probabilmente esposti ad un’eccessiva risposta anticoagulante e a complicazioni emorragiche.

Data l’elevata frequenza dei polimorfismi del CYP2C9 associati a scarso metabolismo della warfarina, l’analisi del genotipo CYP2C9 trova un ruolo fondamentale nella messa a punto del trattamento farmacologico con la warfarina.

Riduzione del dosaggio di Warfarina dosage in base al genotipo CYP2C9

Genotipo CYP2C9

Dosaggio

(% riduzione rispetto al genotipo normale)

CYP *1/*1 (normale)

100%

CYP *1/*2

81

CYP *1/*3

70

CYP *2/*2

62

CYP *2/*3

51

CYP *3/*3

40

Thrombosis & Haemostasis 91,87 2004

CYP2C9 e Terapia antiepilettica con fenitoina

Gli effetti del genotipo CYP2C9 sulle proprietà farmacocinetiche della fenitoina sono stati studiati nel trattamento con tale farmaco contro l’epilessia. La presenza del genotipo CYP2C9 *3 costituisce una condizione di scarsa capacità di metabolizzare la fenitoina.

Analogalmente a quanto illustrato per la terapia anticoagulante con la warfarina, grazie alla genotipizzazione CYP2C9, il principale enzima coinvolto nel metabolismo della fenitoina, è possibile effettuare un aggiustamento della dose soprattutto nelle fasi iniziali di trattamento al fine di abbassare il rischio di intossicazione dipendente dal dosaggio nei soggetti con genotipo associato a scarsa capacità di metabolizzare la fenitoina.

Farmaci metabolizzati attraverso l’attività del gene CYP2C9

Questa lista non include tutti i farmaci in commercio ed ha soli fini esemplificativi.

Substrati del citocromo P-450 2C9

aceclofenac

cyclophosphamide

phenacetin

zileuton

acenocoumarol

dapsone

phenytoin

zolpidem

alosetron

desogestrel

porprofol

amitriptyline

dextromethorphan

progesterone

amprenavir

diclofenac

sertraline

antipyrine

diltiazem

tamoxifen

candesartan

fluoxetine

trimipramine

carvedilol

fluvastatin

valproic acid

celecoxib

halofantrine

warfarin

cloazapine

methadone

zafirlukast

Substrates refers to drugs that are either activated or deactivated by the pathway.

Inibitori del citocromo P-450 2C9

delavirdine

fluvoxamine

nifedipine

phenylbutazone

fluconazole

loratidine

omeprazole

fluvastatin

nicardipine

paroxetine

Inhibitors refers to drugs that reduce the ability of the pathway to process drugs. Co- admin istration will decrease the rate of metabolism of drugs through the metabolic pathway listed, increasing the possibility of toxicity.

Induttori del citocromo P-450 2C9

dexamethasone

rifampin

secobarbital

Inducers refers to drugs that increase the activity of a pathway. Co- admin istration increases the rate of excretion for drugs metabolized through the pathway indicated, reducing the drug’s effectiveness.

Laboratorio infertilità/sterilità di coppia

ITER DIAGNOSTICO – ALGORITMI DIAGNOSTICI – FLOWCHART esami per infertilità napoli

RIFERIMENTI :

  • Linee Guida Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS)
  • American Fertility Society (AFS)
  • European Society of Human Reproduction and Embriology (ESHRE)
  • National Institute for Clinical Excelence (NICE)
  • Cochrane Library

ITER DIAGNOSTICO INIZIALE  NELLA DONNA

– Anamnesi personale, patologica prossima e remota

  • Età
  • Peso, altezza (BMI)
  • Attività lavorativa
  • Attività sportiva
  • Appendicopatie e pregressi interventi chirurgici
  • Malattie a trasmissione sessuale, infezioni genitali e/o cistiti ricorrenti
  • TBC
  • Interventi chirurgici pelvici (indicazione, decorso, esame istologico)
  • Chemio e/o radioterapia per patologie neoplastiche
  • Assunzione attuale o pregressa di farmaci
  • Fumo e assunzione di alcolici
  • Disturbi della sfera psicoemotiva.

– Anamnesi per ricerca condizioni associate ad  aumentato rischio riproduttivo

  • Consanguineità
  • Ritardo mentale
  • S. di Down
  • Spina bifida e DTN
  • Fibrosi cistica
  • Talassemia
  • Favismo
  • Distrofia muscolare
  • Diabete mellito
  • Malformazioni
  • Tumori (seno, ovaio, colon-retto)
  • Menopausa <45 anni

Valutare il grado di rischio a priori in relazione al grado di parentela :

  • Grado I      genitori, figli, fratelli
  • Grado II     zii, cugini
  • Grado III    nonni

– Anamnesi ginecologica e ostetrica

  • Età del menarca
  • Carattere del ciclo mestruale
  • Dismenorrea primaria o secondaria, carattere della dismenorrea e presenza di algie pelviche

anche non correlate al flusso mestruale o di una ovulalgia ricorrente

  • Modificazioni mammarie e presenza attuale o pregressa di galattorrea
  • Pregresse gravidanze e loro decorso
  • Uso pregresso di contraccettivi, complicanze e condizioni determinanti la sospensione
  • Periodo effettivo di ricerca di una gravidanza , tempo di sospensione uso contraccettivi

– Anamnesi sessuale

– Anamnesi psicologica

– Esame obiettivo ed ecografico.

ITER DIAGNOSTICO INIZIALE NELL’UOMO

– Anamnesi personale, patologica prossima e remota

  • Età, razza
  • Attività lavorativa e sportiva
  • Anamnesi familiare positiva per infertilità, aborti, patologie genetiche, metaboliche ed endocrinologiche
  • Malattie apparato urogenitale(criptorchidismo, traumi testicolari, orchiti, epididimiti, prostatiti, varicocele, malattie sessualmente trasmesse e patologie ostruttive)
  • Pregressi interventi vie genitali(varicolecectomia, ernia inguinale, ecc)
  • Cmemio e/o radioterapia
  • Assunzione farmaci

– Esame obiettivo generale( peso, altezza, circonferenza vita, pressione arteriosa, esame fisico generale, caratteri sessuali secondari, ginecomastia) e andrologico(pene, testicoli, epididimi, vasi deferenti, volume testicolare, varicocele, esporazione inguinale e rettale).

ACCERTAMENTI PRELIMINARI PRECONCEZIONALI NELLA COPPIA

– Partner femminile

  • Emogruppo e fattore Rh
  • Test di Cooms indiretto (se indicato)
  • Emocromo e ferritina
  • Ab anti Rosolia, Toxo, Cito IgG e IgM
  • HbsAg
  • HCV
  • Tpha
  • Hiv test
  • Pap Test
  • Mammografia e/o ecografia mammaria( in base all’età della pz. e alla condizione specifica di rischio anamnestico).

– Partner maschile

  • Emogruppo e fattore Rh
  • Screening mutazioni FC
  • HbsAg
  • HCV
  • Tpha
  • Hiv test

– Se all’anamnesi della donna è presente una della seguenti condizioni :

  1. Pregressi episodi trombotici arteriosi o venosi(superficiali o profondi) all’anamnesi personale e familare
  2. Pregressi eventi ostetrici avversi come aborti spontanei, preeclampsia, distacco di placenta, IUGR

eseguire screening Trombofilia

  • ATIII
  • Prot. C e S
  • Fattore V Leyden
  • Fattore II
  • Omocisteina
  • LLAC
  • Ab anti Cardiolipina.

DIAGNOSTICA DI LABORATORIO E STRUMENTALE

3 LIVELLI DI INDAGINI( INDAGINI DI PRIMO, SECONDO E TERZO LIVELLO)

I Livello

– Coppia con partner femminile di età<35 anni, normopeso, cicli regolari, assenza di fattori anamnestici o clinici di aumentato rischio, non segni di iperandrogenismo, non elementi di rilievo all’esame obiettivo ed ecografico, non accertamenti pregressi per infertilità.

  1. Anatomia basale utero e annessi – test di pervietà tubarica
    1. Ecografia trans vaginale morfofunzionale ad alta risoluzione
    2. Isterosalpingografia(ISG) o Isterosalpingosonografia(SIS)
  2. Fattore ovarico, disendocrinopatie di base, esiti di flogosi pelvica
    1. Dosagggio plasmatico basale(3° giorno ciclo +/- 24h) di FSH, LH, 17beta-estradiolo,TSH, Ab antiClamidia IgG su siero(dosaggio quantitativo)
  3. Fattore ovulatorio e fase luteale(ciclo intervallo medio 28gg)
    1. Dosaggio 21° giorno ciclo di Progesterone plasmatico
    2. Dosaggio 24° giorno ciclo di Progesterone e Prolattina
  4. Fattore flogistico infiammatorio
    1. Tampone vaginale + cervicale per ricerca clamidia e micoplasma
  5. Fattore maschile
    1. Esame liquido seminale e test di separazione nemaspermica
    2. Ecocolordoppler testicolare
    3. Dopo 30gg -> esame liquido e Martest.